Articoli correlati ai problemi ematologici nella Malattia di Gaucher.

Alterazioni della funzionalità piastrinica in pazienti affetti da Malattia di Gaucher

 

INTRODUZIONE

La malattia di Gaucher tipo I (deficit di b-glucocerebrosidasi) è il più frequente disturbo ereditario da accumulo lisosomiale ed è caratterizzata da un progressivo accumulo di b-glucocerebroside nelle cellule del sistema reticoloendoteliale, con infiltrazione a livello del midollo osseo, epatosplenomegalia, lesioni scheletriche (1). Il sintomo più frequente, presente in circa la metà dei pazienti (2), è rappresentato dalle manifestazioni emorragiche, che sono comunemente attribuite alla piastrinopenia, dovuta sia alle dimensioni aumentate della milza (sindrome da ipersplenismo), sia all’infiltrazione del midollo osseo da parte delle cellule di Gaucher, che ostacolano la produzione delle piastrine stesse da parte dei loro progenitori (megacariociti). Il riscontro frequente di emorragie severe, anche in pazienti con conta piastrinica nella norma, ha indotto a ricercare altri fattori di rischio emorragico presenti nella malattia di Gaucher. Numerosi studi hanno così dimostrato una riduzione dei livelli di alcuni fattori della coagulazione (3,4) e recenti dati hanno rivelato un’alterazione dell’aggregazione piastrinica nel 22% dei soggetti esaminati (5). Per cercare di caratterizzare meglio l’alterata funzionalità piastrinica, abbiamo iniziato a studiarne sistematicamente i diversi aspetti evidenziando un disordine complesso, che si riduce progressivamente con la terapia enzimatica sostitutiva.

MATERIALI E METODI

La ricerca è stata condotta su 4 pazienti (3 femmine ed 1 maschio), seguiti presso il Centro Emofilia di Firenze, affetti da malattia di Gaucher tipo I, di età media 30 anni. All’esordio tutti presentavano sintomatologia emorragica spontanea (petecchie, ecchimosi, epistassi) e splenomegalia, eccetto due in precedenza sottoposti a splenectomia. Le indagini di laboratorio sono state eseguite su campioni di sangue periferico prelevato dopo 6 e 36 mesi dall’inizio della terapia enzimatica sostitutiva (6) con imiglucerasi (Cerezyme, Genzyme) alla dose media di 52 U/Kg/ mese (range: 20-120 U/Kg/mese). Sono stati effettuati i seguenti esami ematologici routinari (7): tempo di sanguinamento secondo Ivy, conta piastrinica, aggregazione piastrinica secondo Born. Con tecnica citofluorimetrica (8) sono stati analizzati:

  • Fenotipo della membrana piastrinica mediante valutazione dell’espressione della glicoproteina Ib (GpIb), recettore per il fattore von Willebrand e della glicoproteina IIbIIIa (GpIIbIIIa), recettore per il fibrinogeno;
  • Stato di attivazione piastrinica mediante la valutazione della exocitosi degli a-granuli (espressione della P-selectina, GMP-140) e dei lisosomi (espressione della glicoproteina 53, Gp53) a riposo;
  • Attivabilità piastrinica mediante l’analisi dell’espressione della GMP-140 e Gp53 dopo stimolo agonista ADP+Adrenalina;
  • δ-granuli mediante la valutazione del contenuto in nucleotidi adeninici con l’impiego del flurocromo quinacrina;
  • Piastrine reticolate mediante il flurocromo arancio di tiazolo.

RISULTATI

Le prove di aggregazione piastrinica eseguite dopo 6 mesi dall’inizio della terapia mostravano in 3 su 4 pazienti una ridotta risposta al collagene, ADP, epinefrina; dopo 36 mesi, invece, si è ottenuta una normalizzazione dei test.
Il tempo di sanguinamento (v.n.: 3-8 minuti), che era significativamente allungato (range: 9-15 minuti) a sei mesi di trattamento, si è normalizzato a 36 mesi.

La conta piastrinica (v.n.: 140-440×109/L) effettuata a sei mesi mostrava trombocitopenia in 1 dei 2 pazienti non splenectomizzati (90×109/L) ed il seguente range: 90-180×109/L. Dopo 36 mesi di terapia si è ottenuta una significativa crescita del numero delle piastrine (range: 116-264 x109/L), tranne in un soggetto che si era trattato con discontinuità per un lungo periodo di tempo.

Lo studio del fenotipo piastrinico eseguito dopo i primi 6 mesi di terapia ha mostrato una lieve riduzione dell’espressione della GpIb (canale medio di fluorescenza c.m.f.: 335/ v.n.:350-430) in 1 su 4 pazienti, associata ad una normale esposizione della GpIIbIIIa (v.n.: 460-590). Dopo 36 mesi, l’espressione di entrambe le glicoproteine è risultata aumentata e compresa nel range di normalità . La valutazione dello stato di attivazione piastrinica ha mostrato il seguente andamento:

Dopo 6 mesi di terapia:

GMP-140 basale ai limiti inferiori del range normale (v.n.: 0.03-0.23 Parametro D KS Stat.) in 4 su 4 campioni Gp53 basale ai limiti inferiori del range normale (v.n.: 0-0.26 Parametro D KS Stat.) in 1 su 4 campioni.

Dopo 36 mesi di terapia:

GMP-140 basale oltre il valore normale in 2 su 4 pazienti Gp53 basale significativamente aumentata in 4 su 4 pazienti.
La valutazione dell’attivabilità piastrinica, intesa come espressione della GMP-140 e della Gp53 dopo stimolo agonista con ADP+Adrenalina ha dato i seguenti risultati:

Dopo 6 mesi di terapia:

GMP-140 fortemente ridotta in 2 su 4 soggetti ed al limite inferiore della norma nei restanti (v.n.: 0.6-0.8 Parametro D KS Stat.).
Gp53 fortemente ridotta in 1 su 4 pazienti, normale nei restanti (v.n.: 0.26-0.82 Parametro D KS Stat.).

Dopo 36 mesi di terapia:

GMP-140 con valori normali in 4 su 4 campioni;
Gp53 con valori normali in 4 su 4 pazienti.
La valutazione del contenuto in nucleotidi adeninici (d-granuli) e delle piastrine reticolate, eseguita solo dopo 36 mesi di terapia, ha dimostrato in tutti i campioni una significativa riduzione del contenuto dei d-granuli ed una normale percentuale di piastrine reticolate.

CONCLUSIONI

I pazienti affetti da malattia di Gaucher hanno rivelato un’alterata funzionalità piastrinica espressa da una ridotta aggregabilità a ADP, Adrenalina e Collageno, da una diminuita exocitosi degli a- granuli e lisosomi dopo stimolo agonista (ADP+Adrenalina) e da un allungamento del tempo di emorragia, indipendentemente dai valori della conta piastrinica. Lo scarso livello di attivazione piastrinica evidenziato dall’analisi della GMP-140 e Gp53 e la pur non frequente riduzione della GpIb insieme ai difetti funzionali descritti, supportano l’idea che un difetto piastrinico quantitativo e qualitativo sia caratteristica peculiare della malattia. Il dato più significativo che emerge dalla nostra valutazione è il netto miglioramento dei parametri piastrinici esaminati, conseguente al trattamento enzimatico sostitutivo continuativo.

Ci proponiamo di seguire nel tempo l’andamento degli stessi indici di funzionalità piastrinica e di arruolare nuovi pazienti in questo studio. Sarebbe interessante poter effettuare una valutazione dei parametri descritti al momento stesso della diagnosi, prima di iniziare la terapia sostitutiva, come è

stato possibile fare solo in un caso dei 4 presentati. In conclusione, la piastrinopenia, associata a difetti funzionali piastrinici multipli ed alla riduzione di alcuni fattori della coagulazione, può spiegare le gravi manifestazioni emorragiche frequentemente osservate nella malattia di Gaucher. L’efficacia della terapia è stata supportata dalla significativa riduzione della frequenza ed entità delle manifestazioni emorragiche dei pazienti esaminati.

 

Silvia Linari, Sandro Cinotti, Enrica Paladino, Giovanni Longo, Massimo Morfini.

Centro Emofilia, Divisione di Ematologia, Azienda Ospedaliera Careggi, Firenze.

 

Alterazioni coagulative nella Malattia di Gaucher

 

INTRODUZIONE

La malattia di Gaucher è un disordine genetico di tipo autosomico-recessivo secondario a deficit di b-glucocerebrosidasi (glucosyl-ceremidasi), noto enzima indispensabile per la degradazione lisosomiale dei glucocerebrosidi. (1-3). Ne consegue un loro accumulo nei lisosomi delle cellule monocitiche-macrofagiche che assumono così un aspetto caratteristico: le cosiddette cellule di Gaucher. Queste si ritrovano prevalentemente nella milza, nel fegato, nel midollo osseo e talora in altri organi quali: polmoni, reni, cuore, occhi, sistema linfatico e più raramente nel sistema nervoso. (4-6).

La malattia di Gaucher tipo I è la forma più comune e si distingue dalle varianti tipo II e III per l’assenza di sintomi neurologici. (4).
Il quadro clinico è molto eterogeneo ed è caratterizzato da vari gradi di epatosplenomegalia, lesioni scheletriche e pancitopenia, quest’ultima secondaria alla più o meno cospicua splenomegalia che all’infiltrazione midollare di cellule di Gaucher. (1).
In generale i disordini emorragici nei pazienti affetti da malattia di Gaucher sono sempre stati ritenuti legati esclusivamente alla piastrinopenia.
Recentemente, invece sono stati descritti significativi deficit di alcuni fattori plasmatici della coagulazione ed alterazioni funzionali delle piastrine (piastrinopatia) che sicuramente contribuiscono alla diatesi emorragica di tali pazienti. (7-10).
Infatti, in circa il 30-60% dei pazienti con malattia di Gaucher tipo I sono stati riportati, da diversi Autori, deficit delle attività dei fattori XI, XII, VII, X, V, VIII, II, di alcuni inibitori naturali della coagulazione quali la Proteina C coagulativa (PC), la Proteina S (PS), l’Antitrombina III (AT III) ed aumentati livelli di anticorpi anti-cardiolipina (ACA). (8-11-15).
Dal punto di vista del trattamento, l’introduzione nell’ultimo decennio della terapia enzimatica sostitutiva, con Alglucerasi (enzima estratto dalla placenta umana) prima ed Imiglucerasi (enzima di sintesi ottenuto con la tecnica del DNA ricombinante) dopo, ha significativamente cambiato il decorso della malattia di Gaucher. (16-18). Utilizzando l’enzima a diversi dosaggi è possibile, infatti, ridurre o normalizzare l’epato-splenomegalia, la pancitopenia e di determinare un parziale incremento dei fattori plasmatici della coagulazione deficitari. (15-19-22).
Allo scopo, di valutare la presenza di alterazioni coagulative e la loro parziale correlazione dopo terapia enzimatica sostitutiva, abbiamo condotto uno studio su cinque pazienti affetti da malattia di Gaucher tipo I, giunti alla nostra osservazione negli ultimi cinque anni.

MATERIALI E METODI

Pazienti

Sono stati studiati 5 pazienti (4 maschi e 1 femmina) di età compresa tra 24 e 45 anni (età media 35,5). La diagnosi di malattia di Gaucher tipo I era stata posta in base ai livelli enzimatici di glucocerebrosidasi e all’esame del midollo osseo (presenza di cellule di Gaucher). In accordo con il Severity score Index, i segni clinici erano lievi in tre soggetti, moderati-severi negli altri due rispettivamente. Tre di essi erano stati splenectomizzati. I due pazienti con segni clinici moderati-

severi, sono stati sottoposti a terapia enzimatica sostitutiva con Imiglucerasi (Cerazyme, Genzyme Therapeutics, Mass., USA) al regime di basso dosaggio- e somministrazioni frequenti. (15 U/Kg per mese, due volte la settimana.

Metodi

I parametri coagulativi valutati sono stati:

  • Attività Protrombinica (AP) ricavata dall’esecuzione del tempo di protrombina (sec. Quick), utilizzando tromboplastina calcica ottenuta per estrazione da placenta umana. (Instrumentation Laboratory Milano) (I, L,).
  • Tempo di Tromboplastina parziale attivato (aPTT) eseguito con reagente sostitutivo tromboplastinico secondo procedura standard (I, L, Milano).
  • Determinazione della fibrinogenemia sec. Clauss (I, L, Milano).
  • Dosaggio delle attività funzionali dei fattori della coagulazione: FII, V, VII, VIII, IX, XI,
  • XII, XIII, determinato con metodo one-stage coagulativo adoperando plasmi-substrato carenti (I, L, Milano).
  • Dosaggio degli inibitori naturali della coagulazione: Proteina C coagulativa (PC), Proteina S (PS), Antitrombina III (AT III), mediante kits forniti dalla I, L, Milano.
  • Prova d’incrocio (mixing PTT test) con plasma umano normale e plasma paziente, nel rapporto 1:1.
  • Dosaggio anticorpi anti-cardiolipina (ACA) e anti-fosfolipidi (APA, IgG e IgM) dosati con metodica E.L.I.S.A. (IPRA, UK).

Le prove emocoagulative, i dosaggi dei singoli fattori, degli inibitori naturali della coagulazione e degli APA e ACA sono stati eseguiti prima e dopo l’inizio della terapia enzimatica sostitutiva, ogni 6 mesi per 18 mesi in tutti i campioni di plasma depiastrinizzato ottenuti da sangue anticoagulato mediante sodio-citrato (3.8% nel rapporto 9:1, dopo centrifugazione a 3.0000 r.p.m. Per le metodiche coagulative è stato impiegato il coagulometro automatico ACL 3.000 Plus (I, L, Milano).

RISULTATI

Risultati In tutti i pazienti, all’inizio del nostro studio, la funzionalità epatica, il tempo di protrombina ed il fibrinogeno erano normali, mentre il tempo di tromboplastina parziale attivato era significativamente allungato (Tab. I). In tre pazienti (60%) era presente una attività tipo Lupus anticoagulante (LAC) con prova di incrocio a due ore d’incubazione dell’aPTT positiva (ratio positiva quando > 1.2), associata ad un aumento significativo degli anticorpi antifosfolipidi sia di tipo IgM (media 29 + 1.2 U/ml, vn < 15). Uno di tali tre pazienti presentava anche un incremento degli anticorpi anticardiolipina (2.7 U/ml vn < 1,5) e positività per la VDRL. (Tab. II).
In riferimento alle attività funzionali dei singoli fattori plasmatici della coagulazione, il fattore V era ridotto (< 50%) in tutti (100%) i soggetti, mentre i fattori VIII e XI erano diminuiti rispettivamente in tre (60%) e in due (40%) pazienti. Inoltre, un paziente, (20%) presentava anche una riduzione dei fattori II e IX e due (40%) una significativa riduzione dei livelli di Proteina S e di Antitrombina III (Tab. III).
In due pazienti con positività per LAC ed incremento di APA e ACA i segni clinici della malattia di Gaucher erano moderati-severi rispettivamente, quindi sono stati sottoposti a terapia enzimatica sostitutiva.
In essi, dopo 18 mesi di trattamento, abbiamo osservato un significativo aumento dei fattori II, V, VII, IX; XI e della PS.
Tuttavia l’aPTT rimaneva ancora allungato e persisteva l’aumento dei livelli serici di APA e di ACA, così come rimaneva positiva la VDRL. (Tab. 4).
In nessuno, comunque, dei pazienti con positività per LAC ed incremento di APA e ACA i segni clinici della malattia di Gaucher erano moderati-severi rispettivamente, quindi sono stati sottoposti a terapia enzimatica sostitutiva. In essi, dopo 18 mesi di trattamento, abbiamo osservato un significativo aumento dei fattori II, V, VII, IX, XI e della PS. Tuttavia l’aPTT rimaneva ancora allungato e persisteva l’aumento dei livelli sierici di APA e di ACA, così come rimaneva positiva la

VDRL. (Tab. 4). In nessuno comunque, dei tre pazienti con positività per LAC e con incremento di APA e ACA si sono osservate manifestazioni cliniche correlate.

CONCLUSIONI

Conclusioni Questi risultati suggerirebbero che la presenza di auto-anticorpi potrebbe contribuire alle alterazioni coagulative della malattia di Gaucher e riflettere una attivazione del sistema immunitario. Quale sia il vero significato di tali alterazioni coagulative, la positività per LAC e la presenza di APA e ACA nella malattia di Gaucher tipo I resta, comunque, ancora da chiarire. Probabilmente è da correlare al disordine del metabolismo lipidico e quindi secondario all’accumulo di glucocerebrosidi. L’assenza di gravi manifestazioni sia emorragiche che trombotiche può dipendere, a nostro parere, da un equilibrio emostatico tra deficit di fattori coagulativi da un lato e di inibitori della coagulazione dall’altro.

 

Dr. Gaetano Giuffrida, Spec. In Ematologia, Dirigente Medico 1° Livello.

Divisione Clinicizzata di Ematologia, Azienda Ospedaliera Emanuele Ferrarotto – S. Bambino (Catania).